Pewarnaan Gram

I. Tujuan

1. Mempelajari proses pewarnaan struktur sel bakteri yang sekaligus menunjukkan sifat bakteri tersebut.

2. Mengamati, mempelajari dan membedakan bentuk-bentuk dan struktur sel bakteri.

3. Memahami pentingnya setiap langkah dalam prosedur pewarnaan.

II. Teori Dasar

Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian gram pada tahun 1884. Dengan metode ini, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri gram positif dan gram negatif yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp. (Tryana, S.T, 2008).

Struktur bakteri terbagi menjadi dua yaitu:

1. Struktur dasar (dimiliki oleh hampir semua jenis bakteri)
Meliputi: dinding sel, membran plasma, sitoplasma, ribosom, DNA, dan granula penyimpanan

2. Struktur tambahan (dimiliki oleh jenis bakteri tertentu)
Meliputi kapsul, flagelum, pilus, fimbria, klorosom, Vakuola gas dan endospora

Pada prokariota umumnya, semua bakteri memiliki struktur sel yang relatif sederhana. Struktur bakteri yang paling penting adalah dinding sel. Bakteri dapat digolongkan menjadi dua kelompok yaitu :

1. Bakteri Gram positif memiliki dinding sel yang terdiri atas lapisan peptidoglikan yang tebal dan asam teichoic.

2. Bakteri Gram negatif memiliki lapisan luar, lipopolisakarida - terdiri atas membran dan lapisan peptidoglikan yang tipis terletak pada periplasma (di antara lapisan luar dan membran sitoplasmik).

Pada bakteri patogen (pembawa penyakit) biasanya terdapat kapsul atau lapisan lendir yang membantu pelekatan bakteri pada suatu permukaan dan biofilm formation. Bakteri juga memiliki kromosom, ribosom dan beberapa spesies lainnya memiliki granula makanan, vakuola gas dan magnetosom.

Berdasarkan bentuknya, bakteri dibagi menjadi tiga golongan besar, yaitu:

• Kokus (Coccus) adalah bakteri yang berbentuk bulat seperti bola, dan mempunyai beberapa variasi sebagai berikut:

o Mikrococcus, jika kecil dan tunggal

o Diplococcus, jka bergandanya dua-dua

o Tetracoccus, jika bergandengan empat dan membentuk bujursangkar

o Sarcina, jika bergerombol membentuk kubus

o Staphylococcus, jika bergerombol

o Streptococcus, jika bergandengan membentuk rantai

• Basil (Bacillus) adalah kelompok bakteri yang berbentuk batang atau silinder, dan mempunyai variasi sebagai berikut:

o Monobasil, jika hanya berbentuk satu batang

o Diplobacillus, jika bergandengan dua-dua

o Streptobacillus, jika bergandengan membentuk rantai

• Spiril (Spirilum) adalah bakteri yang berbentuk lengkung dan mempunyai variasi sebagai berikut:
o Vibrio, (bentuk koma), jika lengkung kurang dari setengah lingkaran

o Spiral, jika lengkung lebih dari setengah lingkaran

Gambar Bakteri Gram Positif dan Bakteri Gram Negatif

(Edukasi, 2008).

Staphylococcus adalah bakteri Gram-positif yang berbentuk bola. Bakteri ini ada yang berkoloni dan berbentuk seperti buah buah anggur. Pada tahun 1884, Rosenbach menjelaskan ada dua jenis warna staphylococci yaitu: Staphylococcus Aureus yang berwarna kuning dan Staphylococcus albus yang berwarna putih. Beberapa karakterististik yang dimiliki Staphylococcus Aureus diantaranya hemolytic pada darah agar, catalase-oxidase-positif dan negatif, dapat tumbuh pada suhu berkisar 15 sampai 45 derajat dan lingkungan NaCl pada konsentrasi tinggi hingga 15 persen dan menghasilkan enzim coagulase. Selain itu,biasanya S. Aureus merupakan patogen seperti bisul, styes dan furunculosis beberapa infeksi (radang paru-paru, radang kelenjar dada, radang urat darah, meningitis, saluran kencing osteomyelitis dan endocarditis serta menyebabkan keracunan makanan yaitu dengan melepakan enterotoxins menjadi makanan sehingga menjadi toksik dengan melepasan superantigens ke dalam aliran darah (Kenneath, 2008).

Bacillus subtilis merupakan bakteri gram-positif yang berbentuk batang,dan secara alami sering ditemukan di tanah dan vegetasi. Bacillus subtilis tumbuh di berbagai mesophilic suhu berkisar 25-35 derajat Celsius. Bacillus subtilis juga telah berevolusi sehingga dapat hidup walaupun di bawah kondisi keras dan lebih cepat mendapatkan perlindungan terhadap stres situasi seperti kondisi pH rendah (asam), bersifat alkali, osmosa, atau oxidative kondisi, dan panas atau etanol Bakteri ini hanya memilikin satu molekul DNA yang berisi seperangkat set kromosom. DNAnya berukuran BP 4214814 (4,2 Mbp) (TIGR CMR). 4,100 kode gen protein. Beberapa keunggulan dari bakteri ini adalah mampu mensekresikan antibiotik dalam jumlah besar ke luar dari sel (Scetzer, 2006).

Menurut Kenneath tahun (2008), Escherichia coli termasuk dalam famili Enterobacteraceae yang termasuk gram negatif dan berbentuk batang yang fermentatif. E. coli hidup dalam jumlah besar di dalam usus manusia, yaitu membantu sistem pencernaan manusia dan melindunginya dari bakteri patogen. Akan tetapi pada strain baru dari E.coli merupakan patogen berbahaya yang menyebabkan penyakit diare dan sindrom diare lanjutan serta hemolitik uremic (hus). Peranan yang mengguntungkan adalah dapat dijadikan percobaan limbah di air, indikator pada level pencemaran air serta mendeteksi patogen pada feses manusia yang disebabkan oleh Salmonella typhi. (Mikrolibrary, 2008). Endospore adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai kondisi menjadi baik (Ncbi, 2008).

Pewarnaan gram menghasilkan 2 (dua) kelompok besar bakteri, yaitu gram positif yang berwarna ungu dan gram negatif yang berwarna merah. Adanya gram positif dan gram negatif disebabkan oleh perbedaan bandingan dinding sel bakteri. Kandungan senyawa peptidoglikan pada dinding sel gram positif lebih tebal dibandingkan pada dinding gram negatif. Beberapa cara pengecetan, yaitu :

- Pengecetan negatif

- Pengecetan sederhana

- Pengecetan gram

- Pengecetan ziehl nielsen

- Pengecetan kapsul

- Pengecetan spora

- Pengecatan flagella

(Ani Murniati, 2000. Buku Penuntun Praktikum Mikrobiologi)

Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan- pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah memilen biru, krisdal violet dan karbol fuehsin.

(Mila Ermila, 2005, Penuntun Praktikum Mikrobiologi)

Perbedaan 2 kelompok bakteri ini didasarkan pada kemampuan sel menahan (mengikat) warna ungu dari kristal violet selama proses dekolorisasi oleh alkohol. Bakteri gram positif tidak mengalami dekolorisasi karena tetap mengikat warna ungu kristal violet dan pada tahap akhir pengecatan tidak terwarnai safranin. Bakteri gram negatif mengalami dekolorisasi oleh alkohol dan pada tahap akhir pengecatan terwarnai menjadi merah oleh safranin.

Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru.

Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek.

Proses pewarnaan diferensial ini memerlukan 4 jenis reagen. Bakteri terbagi atas dua kelompok berdasarkan pewarnaan ini, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Perbedaan ini berdasarkan warna yang dapat dipertahankan bakteri. Reagen pertama disebut warna dasar, berupa pewarna basa, jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas. Reagen kedua disebut bahan pencuci warna (decolorizing agent). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bilakomponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Reagen terakhir adalah warna pembanding, bila warna tidak tercuci maka warna pembanding akan terlihat, yang terlihat pada hasil akhir tetap warna dasar.

III. Alat dan Bahan

Alat :

• Tabung reaksi steril
• Mikroskop
• Rak tabung reaksi
• Kaca objek
• Pinset
• Kertas lensa
• Ose bundar dan lurus
• Kertas tissue
• Pipet ukur 5 dan 10 ml
• Bunsen
• Papan pembentuk agar miring
• Inkubator 37⁰ C

Bahan :

• Suspensi bakteri ; s.aereus,p. aeruginosa, E.coli.
• Potasium telurite
• Media Mac Conkey Agar (MCA),Vogel Jonsen Agar (VJA),Cetrimide Agar (CA),Simmon sitrat,dan Triple Sugar Iron Agar (TSIA)
• Biakan agar miring bakteri
• Pereaksi pewarna gram
• Oli imersi
• Aqudest

IV. Prosedur kerja

ISOLASI, IDENTIFIKASI,DAN KONFIRMASI MIKROBA

Pertama-tama buatlah media MCA,VJA,dan CA dalam bentuk plat agar,tetapi media Simmon sitrat dan TSIA dalam bentuk agar miring.Kemudian masing-masing media diberi warna sebelum diinokulasi dengan bakteri lalu catat dan dokumentasikan,lalu pada media MCA,VJA,CA,Simmon sitrat,dan TSIA diinokulasikan pada masing-masing suspensi bakteri pada suhu 37⁰ C selama 1 minggu seluruh kultur bakteri di inkubasi pada incubator,lalu lakukan pengamatan setiap hari yang mencakup:

- Warna media : Sebelum diinokulasi dengan bakteri bandingkan dengan warna media

• Secara Keseluruhan

• Di sekitar/sekeliling koloni bakteri

• Pada agar miring TSIA: gambarkan bila ada perbedaan warna sesuai dengan posisi media (di dasar,tengah,dan permukaan tabung).

- Ukuran dan warna koloni bakteri

- Adanya endapan hitam atau retakan pada media

PEWARNAAN GRAM

Bersihkanlah kaca objek dengan alcohol hingga bebas dari lemak,kemudian diflambir dan diberi tanda nama bakteri pada bagian bawah kaca objek,lalu buatlah preparat dari biakan bakteri yang akan diwarnai dengan cara :

- Dengan meletakkan satu tetes suspensi bakteri pada kaca objek,sebarkanlah hingga setipis mungkin dengan membentuk lingkaran dengan diameter 1 cm.

- Di atas api bunsen (fikasi) hangatkan hingga sampai kering

- Warni preparat yang sudah siap

Diamkan lah selama satu menit setelah preparat ditetesi dengan Kristal violet,lalu buang lah sisa zat warna dan bilas dengan lugol lalu tutup preparat dengan lugol biarkan selama 30 detik,setelah itu buanglah lugol,tetesi preparat sedikit demi sedikit dengan menggunakna alcohol 96% hingga bilasan terakhir tetap jernih,kemudian warnai dengan zat warna fuchsin selama 30 detik tetapi sebelumnya preparat di cuci dengan aquadest,setelah 30 detik bilas kembali dengan aquadest biarkan hingga kering,dengan menggunakan mikroskop pembesaran lensa objektif 100x dengan memakai oli imersi dan amati yang ada dibawah mikroskop,hingga bentuk bakteri di dapat lalu catat warna dan susunanya.

V. Data Pengamatan

1.Staphlococcus aereus

Gambar bakteri Staphlococcus aereus yang telah diwarnai

Waktu pengamatan	Warna bakteri/ perbesaran	Bentuk bakteri / perbesaran
22-10-09 pukul 10.24	Bakteri berwarna ungu menggunakan perbesaran 100x	Berbentuk bulat-bulat (coccus) yang berkoloni membentuk kumpulan anggur tetapi tidak beraturan. Menggunakan perbesaran 100x.

2. Escherichia coli

Gambar bakteri Escherichia coli yang telah diwarnai

Waktu pengamatan	Warna bakteri/perbesaran	Bentuk bakteri/perbesaran
22-10-09 pukul 11.52	Bakteri berwarna merah keunguan hampir merah muda dengan menggunakan perbesaran 100x	Berbentuk lonjong panjang (bacillus) yang terbentuk dengan jumlah cukup banyak dan intens tetapi terpisah-pisah seperti rantai yang panjang dengan menggunakan perbesaran 100x

VI. Pembahasan

Pada praktikum kali ini, praktikan melakukan teknik pewarnaan gram yang ditujukan untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Yang menjadi bakteri sebagai bahan uji pada praktikum kali ini adalah Staphlococcus aereus dan Escherichia coli .

Pewarnaan gram ini menggunakan 4 macam pewarna dengan fungsi yang berbeda. Proses perwarnaan itu sendiri dilakukan dengan membersihkan gelas objek dan gelas penutup dengan alkohol 70% untuk sterilisasi agar tidak kontaminasi. Kemudian ditetesi aquades steril untuk meletakkan bakteri dan dibuat preparat apusan dari biakan miring agar mudah diamati dan difiksasi Sampel disuspensikan sampai homogen agar bakteri dapat menyebar di gelas objek dan tidak menumpuk. Kemudian difiksasi di atas api yang bertujuan untuk membunuh bakteri secara cepat dengan tidak merubah bentuk dan struktur bakteri, melekatkan bakteri di atas objek gelas dan meningkatkan sifat salinitas pewarna (Tortora, 2002).

Proses pewarnaan bakteri diawali dengan kristal violet dan didiamkan selama satu menit. pewarnaan dilakukan 1 menit agar cat ini dapat melekat sempurna pada dinding bakteri sehingga pengikatan warna oleh bakteri menjadi lebih kuat. Setelah perlakuan pewarnaan, preparat selalu dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan,setelah itu ditetesi dengan lugol dan tetesi dengan preparat dengan alkohol 96%, tetes demi tetes. Hal ini dimaksudkan karena alkohol dapat membuat bakteri tidak berwarna dan berfungsi untuk melunturkan cat sebelumnya, dilakukan selama 1 menit agar cat dapat luntur secara sempurna dan tidak ada yang tersisa. dikeringanginkan bertujuan agar warna melekat pada bakteri dan segera kering sehingga bila diwarnai lagi warna sebelumnya tidak tercampur dengan warna yang baru. Kemudian dilihat di bawah mikroskop dengan perbesaran 100 x agar dapat mengamati bentuk dan warna sel bakteri. Bakteri gram positif akan berwarna ungu, sedangkan bakteri gram negatif akan berwarna merah.

Sesuai dengan tujuan pewarnaan gram tersebut praktikan mendapatkan hasil bahwa terdapat perbedaan antara kedua bakteri tersebut setelah diwarnai, yaitu pada:

- Kriteria Warna Staphlococcus aereus

Ketika warna bakteri menjadi ungu setelah diwarnai, bakteri mengindikasikan bahwa bakteri Escherichia coli termasuk ke dalam golongan gram positif karena berdasarkan literatur, bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol.

- Kriteria warna Escherichia coli

Bakteri Escherichia coli setelah diwarnai menunjukkan warna keunguan yang hampir menyerupai merah muda. Berdasarkan literatur hal ini menandakan bahwa bakteri Escherichia coli merupakan bakteri dengan gram negatif karena gram negatif tidak mempertahankan zat warna metil ungu. Pewarna penimbal setelah diberikan metil ungu membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda.

Karakter warna yang berbeda ini terjadi karena terdapatnya perbedaan struktur dinding sel masing-masing bakteri dan responnya terhadap sifat asam-basanya. Karena pada dasarnya pewarnaan ini melibatkan adanya ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa.Pewarna asam dapat tejadi karena bila senyawa pewarna bermuatan negatif. Dalam kondisi pH mendekati netral dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif, sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel, maka sel tidak berwarna. Sementara Pewarnaan basa bisa terjadi bila senyawa pewarna bersifat positif, sehingga akan diikat oleh dinding sel bakteri dan sel bakteri jadi terwarna dan terlihat.

Selain digunakan untuk mengelompokkan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif , percobaan ini juga ditujukkan untuk mengamati morfologi, baik bentuk maupun susunan sel. Berdasarkan hasil pengamatan, didapat bahwa :

- Staphlococcus aereus

Berbentuk bulat-bulat (coccus) yang berkoloni membentuk kumpulan anggur tetapi tidak beraturan, sesuai dengan karakteritik Staphlococcus aereus berdasarkan literatur yang berkarakter sebagai bakteri Gram-positif yang berbentuk bola. Bakteri ini ada yang berkoloni dan berbentuk seperti buah buah anggur sama seperti yang terlihat di kaca preparat dengan pembesaran 100x.

- Escherichia coli

Berbentuk lonjong panjang (bacillus) yang terbentuk dengan jumlah cukup banyak dan intens tetapi terpisah-pisah seperti rantai yang panjang, sesuai dengan karakteritik Escherichia coli berdasarkan literatur yang berkarakter sebagai bakteri yang termasuk gram negatif dan berbentuk batang yang fermentatif (kenneath, 2008) Koloninya tersusun seperti rantai memanjang sama seperti yang terlihat di kaca preparat dengan pembesaran 100x.

VII. Kesimpulan

- Jadi, untuk mengelompokkan bakteri berdasarkan reaksinya terhadap warna dapat dilakukan dengan teknik pewarnaan yang disebut pewarnaan gram. Dengan pewarnaan gram bakteri dibedakan menjadi dua kelompok, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Teknik pewarnaan gram berproses pada kemampuan sel yang menahan (mengikat) warna ungu dari kristal violet selama proses dekolorisasi dengan alkohol. Bakteri gram positif tidak mengalami dekolorisasi karena tetap mengikat warna ungu kristal violet sehigga pada tahap akhir bakteri gram positif berwarna ungu seperti contohnya Staphlococcus aereus sedangkan bakteri gram negatif mengalami dekolorisasi oleh alkohol sehingga pada tahap akhir pewarnaan terwarnai menjadi kemerahan karena bakteri gram negatif tidak mempertahankan zat warna ungu kristal violet seperti contohnya Escherichia coli.

- Dengan pewarnaan gram ini juga dapat membedakan bentuk-bentuk bakteri. Ada yang berbentuk bola (coccus) dan ada juga yang berbentuk batang/ silinder (bacillus).

- Dalam teknik pewarnaan gram ini dilakukan dengan melalui:

1. Pewarnaan primer menggunakan kristal violet.

2. Pengikatan warna dengan cara didiamkan.

3. Pencucian warna menggukan air.

4. Pewarna pengganti menggunakan larutan lugol.

VIII. Daftar Pustaka

1. - Pelczar J. Michael dan e.s.c Chan, 2006, dasar-dasar mikrobiologi, UIP : Jakarta

2. -http://otetatsuya.wordpress.com/2008/12/24/efek-antibakteri-ekstrak-jahe-zingiber-officinale-roxb-dalam-menghambat- pertumbuhan-koloni-bakteri-escherichia-coli-dan-bacillus-subtilis/ , diakses pada tanggal 25 oktober 2009

3. - http://id.answers.yahoo.com/question/index?qid=20090426032325AA0leMk, diakses pada tanggal 25 oktober 2009

4. - http://makul-rizki.blogspot.com/2008/02/materi-kuliah.html, diakses pada tanggal 25 oktober 2009

5. - http://makul-rizki.blogspot.com/2008/02/materi-kuliah.html, diakses pada tanggal 27 oktober 2009

6. - http://qi206.wordpress.com/2008/10/17/mikroumpewarnaan-gram/, diakses pada tanggal 27 oktober 2009

7. - http://www.e-dukasi.net/mapok/mp_full.php?id=255&fname=materi02.html, diakses pada tanggal 27 oktober 2009

8. - http://makalahdanskripsi.blogspot.com/2008/08/pewarnaan.html, diakses pada tanggal 27 oktober 2009

9. - http://id.answers.yahoo.com/question/index?qid=20080909204931AAhr4TS, diakses pada tanggal 27 oktober 2009