Pewarnaan Gram

I. Tujuan

1. Mempelajari proses pewarnaan struktur sel bakteri yang sekaligus menunjukkan sifat bakteri tersebut.

2. Mengamati, mempelajari dan membedakan bentuk-bentuk dan struktur sel bakteri.

3. Memahami pentingnya setiap langkah dalam prosedur pewarnaan.

II. Teori Dasar

Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian gram pada tahun 1884. Dengan metode ini, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri gram positif dan gram negatif yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp. (Tryana, S.T, 2008).

Struktur bakteri terbagi menjadi dua yaitu:

1. Struktur dasar (dimiliki oleh hampir semua jenis bakteri)
Meliputi: dinding sel, membran plasma, sitoplasma, ribosom, DNA, dan granula penyimpanan

2. Struktur tambahan (dimiliki oleh jenis bakteri tertentu)
Meliputi kapsul, flagelum, pilus, fimbria, klorosom, Vakuola gas dan endospora

Pada prokariota umumnya, semua bakteri memiliki struktur sel yang relatif sederhana. Struktur bakteri yang paling penting adalah dinding sel. Bakteri dapat digolongkan menjadi dua kelompok yaitu :

1. Bakteri Gram positif memiliki dinding sel yang terdiri atas lapisan peptidoglikan yang tebal dan asam teichoic.

2. Bakteri Gram negatif memiliki lapisan luar, lipopolisakarida - terdiri atas membran dan lapisan peptidoglikan yang tipis terletak pada periplasma (di antara lapisan luar dan membran sitoplasmik).

Pada bakteri patogen (pembawa penyakit) biasanya terdapat kapsul atau lapisan lendir yang membantu pelekatan bakteri pada suatu permukaan dan biofilm formation. Bakteri juga memiliki kromosom, ribosom dan beberapa spesies lainnya memiliki granula makanan, vakuola gas dan magnetosom.

Berdasarkan bentuknya, bakteri dibagi menjadi tiga golongan besar, yaitu:

• Kokus (Coccus) adalah bakteri yang berbentuk bulat seperti bola, dan mempunyai beberapa variasi sebagai berikut:

o Mikrococcus, jika kecil dan tunggal

o Diplococcus, jka bergandanya dua-dua

o Tetracoccus, jika bergandengan empat dan membentuk bujursangkar

o Sarcina, jika bergerombol membentuk kubus

o Staphylococcus, jika bergerombol

o Streptococcus, jika bergandengan membentuk rantai

• Basil (Bacillus) adalah kelompok bakteri yang berbentuk batang atau silinder, dan mempunyai variasi sebagai berikut:

o Monobasil, jika hanya berbentuk satu batang

o Diplobacillus, jika bergandengan dua-dua

o Streptobacillus, jika bergandengan membentuk rantai

• Spiril (Spirilum) adalah bakteri yang berbentuk lengkung dan mempunyai variasi sebagai berikut:
o Vibrio, (bentuk koma), jika lengkung kurang dari setengah lingkaran

o Spiral, jika lengkung lebih dari setengah lingkaran

Gambar Bakteri Gram Positif dan Bakteri Gram Negatif

(Edukasi, 2008).

Staphylococcus adalah bakteri Gram-positif yang berbentuk bola. Bakteri ini ada yang berkoloni dan berbentuk seperti buah buah anggur. Pada tahun 1884, Rosenbach menjelaskan ada dua jenis warna staphylococci yaitu: Staphylococcus Aureus yang berwarna kuning dan Staphylococcus albus yang berwarna putih. Beberapa karakterististik yang dimiliki Staphylococcus Aureus diantaranya hemolytic pada darah agar, catalase-oxidase-positif dan negatif, dapat tumbuh pada suhu berkisar 15 sampai 45 derajat dan lingkungan NaCl pada konsentrasi tinggi hingga 15 persen dan menghasilkan enzim coagulase. Selain itu,biasanya S. Aureus merupakan patogen seperti bisul, styes dan furunculosis beberapa infeksi (radang paru-paru, radang kelenjar dada, radang urat darah, meningitis, saluran kencing osteomyelitis dan endocarditis serta menyebabkan keracunan makanan yaitu dengan melepakan enterotoxins menjadi makanan sehingga menjadi toksik dengan melepasan superantigens ke dalam aliran darah (Kenneath, 2008).

Bacillus subtilis merupakan bakteri gram-positif yang berbentuk batang,dan secara alami sering ditemukan di tanah dan vegetasi. Bacillus subtilis tumbuh di berbagai mesophilic suhu berkisar 25-35 derajat Celsius. Bacillus subtilis juga telah berevolusi sehingga dapat hidup walaupun di bawah kondisi keras dan lebih cepat mendapatkan perlindungan terhadap stres situasi seperti kondisi pH rendah (asam), bersifat alkali, osmosa, atau oxidative kondisi, dan panas atau etanol Bakteri ini hanya memilikin satu molekul DNA yang berisi seperangkat set kromosom. DNAnya berukuran BP 4214814 (4,2 Mbp) (TIGR CMR). 4,100 kode gen protein. Beberapa keunggulan dari bakteri ini adalah mampu mensekresikan antibiotik dalam jumlah besar ke luar dari sel (Scetzer, 2006).

Menurut Kenneath tahun (2008), Escherichia coli termasuk dalam famili Enterobacteraceae yang termasuk gram negatif dan berbentuk batang yang fermentatif. E. coli hidup dalam jumlah besar di dalam usus manusia, yaitu membantu sistem pencernaan manusia dan melindunginya dari bakteri patogen. Akan tetapi pada strain baru dari E.coli merupakan patogen berbahaya yang menyebabkan penyakit diare dan sindrom diare lanjutan serta hemolitik uremic (hus). Peranan yang mengguntungkan adalah dapat dijadikan percobaan limbah di air, indikator pada level pencemaran air serta mendeteksi patogen pada feses manusia yang disebabkan oleh Salmonella typhi. (Mikrolibrary, 2008). Endospore adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai kondisi menjadi baik (Ncbi, 2008).

Pewarnaan gram menghasilkan 2 (dua) kelompok besar bakteri, yaitu gram positif yang berwarna ungu dan gram negatif yang berwarna merah. Adanya gram positif dan gram negatif disebabkan oleh perbedaan bandingan dinding sel bakteri. Kandungan senyawa peptidoglikan pada dinding sel gram positif lebih tebal dibandingkan pada dinding gram negatif. Beberapa cara pengecetan, yaitu :

- Pengecetan negatif

- Pengecetan sederhana

- Pengecetan gram

- Pengecetan ziehl nielsen

- Pengecetan kapsul

- Pengecetan spora

- Pengecatan flagella

(Ani Murniati, 2000. Buku Penuntun Praktikum Mikrobiologi)

Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan- pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah memilen biru, krisdal violet dan karbol fuehsin.

(Mila Ermila, 2005, Penuntun Praktikum Mikrobiologi)

Perbedaan 2 kelompok bakteri ini didasarkan pada kemampuan sel menahan (mengikat) warna ungu dari kristal violet selama proses dekolorisasi oleh alkohol. Bakteri gram positif tidak mengalami dekolorisasi karena tetap mengikat warna ungu kristal violet dan pada tahap akhir pengecatan tidak terwarnai safranin. Bakteri gram negatif mengalami dekolorisasi oleh alkohol dan pada tahap akhir pengecatan terwarnai menjadi merah oleh safranin.

Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru.

Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek.

Proses pewarnaan diferensial ini memerlukan 4 jenis reagen. Bakteri terbagi atas dua kelompok berdasarkan pewarnaan ini, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Perbedaan ini berdasarkan warna yang dapat dipertahankan bakteri. Reagen pertama disebut warna dasar, berupa pewarna basa, jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas. Reagen kedua disebut bahan pencuci warna (decolorizing agent). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bilakomponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Reagen terakhir adalah warna pembanding, bila warna tidak tercuci maka warna pembanding akan terlihat, yang terlihat pada hasil akhir tetap warna dasar.

III. Alat dan Bahan

Alat :

• Tabung reaksi steril
• Mikroskop
• Rak tabung reaksi
• Kaca objek
• Pinset
• Kertas lensa
• Ose bundar dan lurus
• Kertas tissue
• Pipet ukur 5 dan 10 ml
• Bunsen
• Papan pembentuk agar miring
• Inkubator 37⁰ C

Bahan :

• Suspensi bakteri ; s.aereus,p. aeruginosa, E.coli.
• Potasium telurite
• Media Mac Conkey Agar (MCA),Vogel Jonsen Agar (VJA),Cetrimide Agar (CA),Simmon sitrat,dan Triple Sugar Iron Agar (TSIA)
• Biakan agar miring bakteri
• Pereaksi pewarna gram
• Oli imersi
• Aqudest

IV. Prosedur kerja

ISOLASI, IDENTIFIKASI,DAN KONFIRMASI MIKROBA

Pertama-tama buatlah media MCA,VJA,dan CA dalam bentuk plat agar,tetapi media Simmon sitrat dan TSIA dalam bentuk agar miring.Kemudian masing-masing media diberi warna sebelum diinokulasi dengan bakteri lalu catat dan dokumentasikan,lalu pada media MCA,VJA,CA,Simmon sitrat,dan TSIA diinokulasikan pada masing-masing suspensi bakteri pada suhu 37⁰ C selama 1 minggu seluruh kultur bakteri di inkubasi pada incubator,lalu lakukan pengamatan setiap hari yang mencakup:

- Warna media : Sebelum diinokulasi dengan bakteri bandingkan dengan warna media

• Secara Keseluruhan

• Di sekitar/sekeliling koloni bakteri

• Pada agar miring TSIA: gambarkan bila ada perbedaan warna sesuai dengan posisi media (di dasar,tengah,dan permukaan tabung).

- Ukuran dan warna koloni bakteri

- Adanya endapan hitam atau retakan pada media

PEWARNAAN GRAM

Bersihkanlah kaca objek dengan alcohol hingga bebas dari lemak,kemudian diflambir dan diberi tanda nama bakteri pada bagian bawah kaca objek,lalu buatlah preparat dari biakan bakteri yang akan diwarnai dengan cara :

- Dengan meletakkan satu tetes suspensi bakteri pada kaca objek,sebarkanlah hingga setipis mungkin dengan membentuk lingkaran dengan diameter 1 cm.

- Di atas api bunsen (fikasi) hangatkan hingga sampai kering

- Warni preparat yang sudah siap

Diamkan lah selama satu menit setelah preparat ditetesi dengan Kristal violet,lalu buang lah sisa zat warna dan bilas dengan lugol lalu tutup preparat dengan lugol biarkan selama 30 detik,setelah itu buanglah lugol,tetesi preparat sedikit demi sedikit dengan menggunakna alcohol 96% hingga bilasan terakhir tetap jernih,kemudian warnai dengan zat warna fuchsin selama 30 detik tetapi sebelumnya preparat di cuci dengan aquadest,setelah 30 detik bilas kembali dengan aquadest biarkan hingga kering,dengan menggunakan mikroskop pembesaran lensa objektif 100x dengan memakai oli imersi dan amati yang ada dibawah mikroskop,hingga bentuk bakteri di dapat lalu catat warna dan susunanya.

V. Data Pengamatan

1.Staphlococcus aereus

Gambar bakteri Staphlococcus aereus yang telah diwarnai

Waktu pengamatan	Warna bakteri/ perbesaran	Bentuk bakteri / perbesaran
22-10-09 pukul 10.24	Bakteri berwarna ungu menggunakan perbesaran 100x	Berbentuk bulat-bulat (coccus) yang berkoloni membentuk kumpulan anggur tetapi tidak beraturan. Menggunakan perbesaran 100x.

2. Escherichia coli

Gambar bakteri Escherichia coli yang telah diwarnai

Waktu pengamatan	Warna bakteri/perbesaran	Bentuk bakteri/perbesaran
22-10-09 pukul 11.52	Bakteri berwarna merah keunguan hampir merah muda dengan menggunakan perbesaran 100x	Berbentuk lonjong panjang (bacillus) yang terbentuk dengan jumlah cukup banyak dan intens tetapi terpisah-pisah seperti rantai yang panjang dengan menggunakan perbesaran 100x

VI. Pembahasan

Pada praktikum kali ini, praktikan melakukan teknik pewarnaan gram yang ditujukan untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Yang menjadi bakteri sebagai bahan uji pada praktikum kali ini adalah Staphlococcus aereus dan Escherichia coli .

Pewarnaan gram ini menggunakan 4 macam pewarna dengan fungsi yang berbeda. Proses perwarnaan itu sendiri dilakukan dengan membersihkan gelas objek dan gelas penutup dengan alkohol 70% untuk sterilisasi agar tidak kontaminasi. Kemudian ditetesi aquades steril untuk meletakkan bakteri dan dibuat preparat apusan dari biakan miring agar mudah diamati dan difiksasi Sampel disuspensikan sampai homogen agar bakteri dapat menyebar di gelas objek dan tidak menumpuk. Kemudian difiksasi di atas api yang bertujuan untuk membunuh bakteri secara cepat dengan tidak merubah bentuk dan struktur bakteri, melekatkan bakteri di atas objek gelas dan meningkatkan sifat salinitas pewarna (Tortora, 2002).

Proses pewarnaan bakteri diawali dengan kristal violet dan didiamkan selama satu menit. pewarnaan dilakukan 1 menit agar cat ini dapat melekat sempurna pada dinding bakteri sehingga pengikatan warna oleh bakteri menjadi lebih kuat. Setelah perlakuan pewarnaan, preparat selalu dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan,setelah itu ditetesi dengan lugol dan tetesi dengan preparat dengan alkohol 96%, tetes demi tetes. Hal ini dimaksudkan karena alkohol dapat membuat bakteri tidak berwarna dan berfungsi untuk melunturkan cat sebelumnya, dilakukan selama 1 menit agar cat dapat luntur secara sempurna dan tidak ada yang tersisa. dikeringanginkan bertujuan agar warna melekat pada bakteri dan segera kering sehingga bila diwarnai lagi warna sebelumnya tidak tercampur dengan warna yang baru. Kemudian dilihat di bawah mikroskop dengan perbesaran 100 x agar dapat mengamati bentuk dan warna sel bakteri. Bakteri gram positif akan berwarna ungu, sedangkan bakteri gram negatif akan berwarna merah.

Sesuai dengan tujuan pewarnaan gram tersebut praktikan mendapatkan hasil bahwa terdapat perbedaan antara kedua bakteri tersebut setelah diwarnai, yaitu pada:

- Kriteria Warna Staphlococcus aereus

Ketika warna bakteri menjadi ungu setelah diwarnai, bakteri mengindikasikan bahwa bakteri Escherichia coli termasuk ke dalam golongan gram positif karena berdasarkan literatur, bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol.

- Kriteria warna Escherichia coli

Bakteri Escherichia coli setelah diwarnai menunjukkan warna keunguan yang hampir menyerupai merah muda. Berdasarkan literatur hal ini menandakan bahwa bakteri Escherichia coli merupakan bakteri dengan gram negatif karena gram negatif tidak mempertahankan zat warna metil ungu. Pewarna penimbal setelah diberikan metil ungu membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda.

Karakter warna yang berbeda ini terjadi karena terdapatnya perbedaan struktur dinding sel masing-masing bakteri dan responnya terhadap sifat asam-basanya. Karena pada dasarnya pewarnaan ini melibatkan adanya ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa.Pewarna asam dapat tejadi karena bila senyawa pewarna bermuatan negatif. Dalam kondisi pH mendekati netral dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif, sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel, maka sel tidak berwarna. Sementara Pewarnaan basa bisa terjadi bila senyawa pewarna bersifat positif, sehingga akan diikat oleh dinding sel bakteri dan sel bakteri jadi terwarna dan terlihat.

Selain digunakan untuk mengelompokkan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif , percobaan ini juga ditujukkan untuk mengamati morfologi, baik bentuk maupun susunan sel. Berdasarkan hasil pengamatan, didapat bahwa :

- Staphlococcus aereus

Berbentuk bulat-bulat (coccus) yang berkoloni membentuk kumpulan anggur tetapi tidak beraturan, sesuai dengan karakteritik Staphlococcus aereus berdasarkan literatur yang berkarakter sebagai bakteri Gram-positif yang berbentuk bola. Bakteri ini ada yang berkoloni dan berbentuk seperti buah buah anggur sama seperti yang terlihat di kaca preparat dengan pembesaran 100x.

- Escherichia coli

Berbentuk lonjong panjang (bacillus) yang terbentuk dengan jumlah cukup banyak dan intens tetapi terpisah-pisah seperti rantai yang panjang, sesuai dengan karakteritik Escherichia coli berdasarkan literatur yang berkarakter sebagai bakteri yang termasuk gram negatif dan berbentuk batang yang fermentatif (kenneath, 2008) Koloninya tersusun seperti rantai memanjang sama seperti yang terlihat di kaca preparat dengan pembesaran 100x.

VII. Kesimpulan

- Jadi, untuk mengelompokkan bakteri berdasarkan reaksinya terhadap warna dapat dilakukan dengan teknik pewarnaan yang disebut pewarnaan gram. Dengan pewarnaan gram bakteri dibedakan menjadi dua kelompok, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Teknik pewarnaan gram berproses pada kemampuan sel yang menahan (mengikat) warna ungu dari kristal violet selama proses dekolorisasi dengan alkohol. Bakteri gram positif tidak mengalami dekolorisasi karena tetap mengikat warna ungu kristal violet sehigga pada tahap akhir bakteri gram positif berwarna ungu seperti contohnya Staphlococcus aereus sedangkan bakteri gram negatif mengalami dekolorisasi oleh alkohol sehingga pada tahap akhir pewarnaan terwarnai menjadi kemerahan karena bakteri gram negatif tidak mempertahankan zat warna ungu kristal violet seperti contohnya Escherichia coli.

- Dengan pewarnaan gram ini juga dapat membedakan bentuk-bentuk bakteri. Ada yang berbentuk bola (coccus) dan ada juga yang berbentuk batang/ silinder (bacillus).

- Dalam teknik pewarnaan gram ini dilakukan dengan melalui:

1. Pewarnaan primer menggunakan kristal violet.

2. Pengikatan warna dengan cara didiamkan.

3. Pencucian warna menggukan air.

4. Pewarna pengganti menggunakan larutan lugol.

VIII. Daftar Pustaka

1. - Pelczar J. Michael dan e.s.c Chan, 2006, dasar-dasar mikrobiologi, UIP : Jakarta

2. -http://otetatsuya.wordpress.com/2008/12/24/efek-antibakteri-ekstrak-jahe-zingiber-officinale-roxb-dalam-menghambat- pertumbuhan-koloni-bakteri-escherichia-coli-dan-bacillus-subtilis/ , diakses pada tanggal 25 oktober 2009

3. - http://id.answers.yahoo.com/question/index?qid=20090426032325AA0leMk, diakses pada tanggal 25 oktober 2009

4. - http://makul-rizki.blogspot.com/2008/02/materi-kuliah.html, diakses pada tanggal 25 oktober 2009

5. - http://makul-rizki.blogspot.com/2008/02/materi-kuliah.html, diakses pada tanggal 27 oktober 2009

6. - http://qi206.wordpress.com/2008/10/17/mikroumpewarnaan-gram/, diakses pada tanggal 27 oktober 2009

7. - http://www.e-dukasi.net/mapok/mp_full.php?id=255&fname=materi02.html, diakses pada tanggal 27 oktober 2009

8. - http://makalahdanskripsi.blogspot.com/2008/08/pewarnaan.html, diakses pada tanggal 27 oktober 2009

9. - http://id.answers.yahoo.com/question/index?qid=20080909204931AAhr4TS, diakses pada tanggal 27 oktober 2009

Sintesis Metil Salisilat

Tujuan Percobaan

Diharapkan mahasiswa dapat memahami metoda sintesis ester dengan melalui reaksi esterifikasi pada percobaan ini.

Teori Dasar

Golongan analgesik non-narkotik seperti asam asetil salisilat ternyata memiliki khasiat anti inflamasi sehingga dapat digunakan untuk mengobati arthitis. Mekanisme Kerja obat ini belum jelas, walaupun diperkirakan dengan hubungan produksi atau penghantar hormon.
Asam salisilat tersedia di alam dalam bentuk ester pada glikosida dan minyak atsiri. Metil ester terkandung dalam minyak gandapura dan minyak aromatik tumbuhan lainnya.
Pada percobaan ini akan disintesis metil salisilat. Ester dapat diperoleh langsung dari asam karboksilat dengan alkohol dengan adanya katalis asam dan dapat diperoleh juga dari alkoholis asam klorida, asam anhidrat dan nitril.
Tahapan reaksi esterifikasi dapat diilustrasikan asam asetat dan etanol:
1. Protonisasi gugus karbonil
2. Adisi alkohol dan pemindahan suatu proton ke salah satu gugus hidroksil.
3. Eliminasi air dan deprotonisasi.
Reaksi pada percobaan ini bersifat reversibel maka kesetimbangan harus dibuat condong ke kanan untuk diperoleh ester dalam jumlah banyak.
Pada kondisi ideal, komposisi campuran kesetimbangan tidak dipengaruhi ada tidaknya katalis, tapi percobaan telah menunjukkan bahwa nilai konstanta kesetimbangan akan menjadi dua kali lipat. Jika ditambahkan sejumlah besar katalis asam maka katalis ini akan mengubah lingkungan dalam sistem dan sebagian dihilangkan melalui hidrasi air yang terbentuk dalam reaksi ini.
Asam salisilat berupa hablur putih biasanya jarum halus serta rasanya agak kemanis-manisan, tajam dan stabil di udara. Warnanya putih dan tidak berbau serta sukar larut dalam air dan benzen namun mudah larut dalam etanol dan eter atau air yang mendidih. Jarak titik leburnya 158 derajat Celcius dan 161 derajat Celcius.

Struktur Kimia Asam Salisilat

Alat dan Bahan

Alat:
1. Corong Pisah
2. Labu Erlenmeyer
3. Batang Pengaduk
4. Pipet Tetes
5. Gelas Kimia
6. Kertas Saring
7. Corong Gelas
8. Labu Bundar 50 mL
9. Kondensor
10. Batu Didih
11. Alat Destilasi

Bahan:
1. 3 mL Asam Sulfat Pekat
2. 14 gr Asam Salisilat
3. 50 mL Metanol
4. Diklorometan
5. Air atau Aquadest
6. Magnesium Sulfat
7. Natrium Bikarbonat


Cara Kerja

Masukkan 14 gr Asam Salisilat dan 50 mL Metanol ke dalam labu bundar 50 mL dan aduk campuran itu. Tambahkan dengan ekstra hati-hati asam sulfat pekat sebanyak 3 mL (bersifat korosif !!!).
Masukkan batu didih ke dalm labu tadi dan sambungkan dengan kondensor tegak lalu reflux kira-kira selama 1 1/2 jam. Setelah direflux, dinginkan larutan pada suhu kamar dan dekantasi ke dalam corong pisah. Yang didalamnya terdapat 5 mL air dan 5 mL diklorometan.
Bilas labu bundar tadi dengan 2-3 mL diklorometan dan tuang bilasan lalu kocok campuran. Pisahkan cairan organik dengan kurang lebih 20 mL air/ aquadest dan kurang lebih 20 mL natrium bikarbonat (hati-hati berbusa). Pisahkan lapisan organik dan masukkan ke dalam labu erlenmeyer. Tambahkan sedikit magnesium sulfat, aduk dan buka penutup biarkan 20 menit.
Saring larutan tersebut ke dalam destilasi kecil, tambahkan batu didih dan suling diklorometan. Setelah tidak ada lagi pelarut yang tersuling, biarkan labu dingin pada suhu ruangan.


Data Pengamatan

Setelah ditimbang, asam salisilat yang digunakan sebanyak 14,0045 gr. Ketika ditambah dengan 50 mL metanol, asam salisilat ini larut dengan cepat dan berwarna bening larutannya.
Penambahan 3 mL asam sulfat pekat ke dalam larutan tadi merubah warnanya menjadi kemerahan walaupun sebentar dan berwarna bening kembali.
Ketika dimasukkan batu didih dan dipasang kondensor tegak lalu direflux selama 1 1/2 jam terjadi pemisahan metanol yang dapat digunakan kembali.
Setelah di dekantasi ke dalam corong pisah yang terdapat 5 mL air dan 5 mL diklorometan didalamnya terjadi pemisahan cairan organik dan air. Namun secara kasat mata, cairan organik dan air tidak dapat terlihat terpisah karena larutannya yang sama-sama berwarna bening.
Untuk yang penambahan natrium bikarbonat serta magnesium sulfat dan penyulingan, tidak dilakukan karena keterbatasannya waktu sehingga produk belum dihasilkan secara murni.


Pembahasan

Pada pembuatan metil salisilat ini mula-mula dicampurkan 14,0045 gr asam salisilat dengan 50 mL metanol ke dalam labu bundar. Asam salisilat ini larut dengan cepat karena pelarutnya menggunakan metanol. Asam salisilat akan larut dengan cepat jika dilarutkan dalam senyawa etanol.
Penambahan asam sulfat pekat sebanyak 3 mL berfungsi untuk sebagai katalis yang sifatnya asam dan hanya untuk memepercepat laju reaksi dengan menurunkan energi aktivasinya. Penambahan asam sulfat ini dilakukan diawal atau terdahulu pada percobaan ini bertujuan agar tidak terjadinya prematur, yaitu terbentuk metil salisilat sebelum waktu yang diinginkan.
Dalam percobaan ini tujuannya untuk mensintesis metil salisilat yang artinya memebentuk metil salisilat.
Reaksi pembentukan metil salisilat:

Struktur kimia untuk katalis asam atau asam sulfat (H2SO4) :

Pemasukkan batu didih ke dalam larutan tadi dan pemasangan kondensor secara tegak dapat dinamakan sebagai reaksi soxlet yang cara kerja atau mekanisme kerjanya sama dengan reaksi destilasi namaun bedanya pada efisiensi pelarut. Metanol yang digunakan pada percobaan ini dapat dipergunakan oleh percobaan yang selanjutnya secara layak karena dengan reaksi soxlet, pelarut dapat terpisah secara efisiensi.

Setelah methanol terpisah secara efisien, larutan yang tadi hanya mengandung asam salisilat, metil salisilat serta air didekantasi tuang dari labu bundar ke dalam corong pisah. Dekantasi ini bertujuan untuk memisahkan pengotor yang dapat terlihat secara kasat mata baik itu pengotor dari dalam alat ataupun dari bahan-bahan yang digunakan.

Corong pisah yang tadi didalamnya sudah terdapat 5 mL

air dan 5 mL diklorometan yang tujuannya untuk memisahkan cairan-cairan organik dengan air karena sifat kepolaran dan perbedaan massa jenisnya. Dalam percobaan ini diklorometan bersifat non polar yang dapat bereaksi atau mengikat metil salisilat. Sedangkan air itu bersifat polar sehingga akan terpisah dengan sendirinya setelah dikocok dan didiamkan. Pengocokan corong pisah tidak boleh kuat-kuat karena untuk mencegah terjadinya pembentukan emulsi. Setelah dikocok dan didiamkan, cairan-cairan organik akan terpisah dengan air namun hal ini tidak dapat dilihat secara kasat mata. Maka dari itu dilakukan pengujian dengan meneteskan air ke dalam corong pisah untuk mengetahui keberadaan air, serta keberadaan diklorometan.

Cairan-cairan organik tadi dpisahkan ke dalam labu Erlenmeyer dan setelah terpisah ditambahkan 20 mL natrium bikarbonat yang berfungsi sebagai penghilang senyawa yang mengandung CH2 CR2.

Natrium bikarbonat + Metil salisilat

Natrium salisilat + CO2 + H2O

Setelah lapisan organik dipisahkan kembali, ditambahkan magnesium sulfat (MgSO4) yang bertujuan untuk mengikat air (polar) yang terbawa ketika pemisahan lapisan organik ke dalam labu Erlenmeyer.

Untuk asam salisilat yang belum teresterifikasi dapat dilakukan destilasi vakum yaitu dengan adanya tekanan yang benar-benar menekan.

Campuran yang telah ditambah MgSO4 dan dibiarkan 20 menit itu dilakukan penyaringan ke dalam destilasi kecil untuk memisahkan pengotor-pengotor yang masih terbawa.

Untuk memurnikan produk atau hasil metil salisilat dilakukan penyulingan diklorometan.

Reaksi penambahan natrium bikarbonat dan magnesium sulfat serta pemurnian dengan cara penyulingan tidak dilakukan oleh praktikan karena keterbatasan waktu.

Gambar 1 Soxlet ketika reaksi reflux

Berkaitan dengan hasil metil salisilat yang dihasilkan kurang memuaskan ada beberapa hal, diantaranya:

1. Keterbatasan waktu praktikum,

2. Alat-alat yang tidak tercuci sempurna,

3. Keterlambatan penambahan asam salisilat atau penambahan asam sulfat yang didahulukan,

4. Terbuangnya asam salisilat di dalam labu bundar, ataupun dialat-alat yang lainnya.

Kesimpulan

Sintesis itu adalah pembuatan suatu zat secara kimiawi. Sintesis metil salisilat adalah pembuatan metil salisilat dengan cara reaksi kimia.

Dari pembuatan metil salisilat ini dapat disimpulkan:

1. Metil salisilat dapat dibuat dengan cara mereaksikan asam salisilat dengan metanol dan asam sulfat sebagai katalis.

2. Ester dapat diperoleh dari reaksi esterifikasi langsung dari asam salisilat dengan metanol dengan katalis asam sulfat.

3. Pemisahan cairan-cairan organik dapat dilakukan dengan cara soxlet dan perbedaan kepolarannya serta perbedaan titik didih (destilasi).

4. Pemisahan pelarut secara efisien dapat dilakukan dengan cara soxlet.

5. Pemurnian metil salisilat dari diklorometan dapat dilakukan dengan cara penyulingan, namun reaksi ini tidak dilakukan karena waktu yang terbatas.

6. Produk atau hasil yang diperoleh tidak murni metil salisilat karena praktikum hanya dilakukan pada sampai penambahan diklorometan. Namun wanginya telah tercium walaupun hasilnya belum murni.

Daftar Pustaka

1. http://www.chem-is-try.org/materi_kimia/sifat_senyawa_organik/alkohol1/reaksi_pengesteran_esterifikasi/ diakses pada tanggal 01 November 2009.

2. American Medical Associated. Drug Evaluations Annual 1993. Chicago: TheAssociation, 1993. p. 1587.

3. Goodman LS, Gilman A, editors. The Pharmacological Basis of 3rd ed. New York: The Macmillan Company, 1966.p. 1052.

4. http://kimia.upi.edu/utama/bahanajar/kuliah_web/2008/Riski%20Septiadevana%200606249_IE6.0/halaman_11.html diakses pada tanggal 01 Novemeber 2009.